kpm CRISPR Activationプラスミド (h): sc-404134-ACT

ヒトLATS2は、Hippoシグナル伝達経路の中核をなすセリン／スレオニンキナーゼをコードしており、YAP/TAZ転写共役因子を制御することで細胞増殖を抑制し、アポトーシスを促進します。リン酸化依存的に核内YAP/TAZ活性を制御することを通じて、LATS2は組織恒常性、接触阻害、細胞周期チェックポイントの完全性の維持に寄与し、さらに中心体機能やストレス応答との関連も示されています。LATS2機能の変化やHippo経路の破綻は、多様な疾患関連の状況において異常な増殖制御やゲノム不安定性としばしば結び付けられており、腫瘍抑制ネットワークの研究対象として広く注目されています。経路収束点に位置するキナーゼとして、LATS2はHippoシグナルと細胞骨格ダイナミクス、ならびに上皮間葉転換（EMT）様の性質を司る転写プログラムとのクロストークを解析するためにも用いられています。

kpm CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性LATS2の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

kpm CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における LATS2 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はLATS2転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性kpmの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のLATS2遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるkpm依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびLATS2発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるkpm経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。