Plasmide CRISPR d'Activation (h) KiSS-1: sc-402710-ACT

Le gène humain KISS1 code le précurseur peptidique KiSS-1, qui est clivé par protéolyse en kisspeptines, des ligands sécrétés du récepteur couplé aux protéines G KISS1R (GPR54). La signalisation kisspeptine–KISS1R active la mobilisation du calcium dépendante de PLC/PKC ainsi que les voies MAPK, intégrant le contrôle neuroendocrinien de la libération de l’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH) et, plus largement, la régulation de l’axe reproducteur. Outre sa fonction endocrine, KISS1 a été impliqué dans la régulation de la migration et de l’invasion cellulaires, avec des effets dépendants du contexte sur le comportement métastatique selon les modèles tumoraux. Des altérations de la signalisation KISS1/KISS1R ont été associées à des troubles de la reproduction et à la biologie des cancers, ce qui en fait un point d’entrée utile pour étudier la signalisation ligand-récepteur et la régulation transcriptionnelle.

KiSS-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KISS1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KiSS-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KISS1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KISS1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KiSS-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KISS1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KiSS-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KiSS-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de KISS1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.