KA2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405272-ACT

GRIK5 codifica a subunidade KA2 do recetor de kainato, um parceiro obrigatório que se associa a outras subunidades de recetores de kainato para formar recetores ionotrópicos de glutamato funcionais em sinapses excitatórias. Os recetores que contêm KA2 contribuem para a transmissão sináptica rápida e para a plasticidade dependente da atividade ao regularem o fluxo de catiões e ao modularem a excitabilidade neuronal, ligando o GRIK5 a redes de sinalização glutamatérgica e a vias a jusante dependentes de cálcio. Através dos seus efeitos na integração sináptica e no equilíbrio excitação/inibição ao nível dos circuitos, a alteração da expressão de KA2 ou da composição do recetor tem sido estudada no contexto de fenótipos do neurodesenvolvimento e neuropsiquiátricos, bem como da suscetibilidade a crises epilépticas. Estas propriedades tornam o GRIK5 um alvo útil para investigar a montagem, o tráfego e a neurotransmissão excitatória de recetores sinápticos em modelos celulares humanos.

KA2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GRIK5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KA2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GRIK5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GRIK5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KA2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GRIK5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KA2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KA2 em células tumorais com expressão de GRIK5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.