INSR/Insulin Receptor Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400075-ACT

INSR codifica o recetor de insulina, uma tirosina quinase recetora transmembranar que se liga à insulina para iniciar a autofosforilação e a sinalização a jusante pelas vias PI3K–AKT e RAS–MAPK. Estas cascatas coordenam a captação de glicose, a síntese de glicogénio, o metabolismo lipídico e um controlo mais amplo do crescimento e da sobrevivência celular, com comunicação cruzada com programas de transcrição regulados por mTOR e FOXO. A atividade do INSR molda a dinâmica de endocitose e reciclagem do recetor e influencia a sensibilidade à insulina ao nível de proteínas adaptadoras, como membros da família IRS. A desregulação da sinalização do INSR está fortemente associada à resistência à insulina e à biologia das doenças metabólicas e também é relevante para alterações na sinalização de crescimento observadas em múltiplos tecidos e em microambientes tumorais.

INSR/Insulin Receptor O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de INSR sem alterar a sequência de ADN subjacente.

INSR/Insulin Receptor O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus INSR em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição INSR, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de INSR/Insulin Receptor. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus INSR nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de INSR/Insulin Receptor no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via INSR/Insulin Receptor em células tumorais com expressão de INSR silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.