Ini1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401485-ACT

SMARCB1 (Ini1) codifica uma subunidade central do complexo de remodelamento de cromatina SWI/SNF (BAF), dependente de ATP, que regula o posicionamento de nucleossomos e a acessibilidade da cromatina. Por meio do controle amplo de programas transcricionais, Ini1 influencia a progressão do ciclo celular, a diferenciação, a especificação de linhagem e as respostas a danos no DNA, modulando a atividade de enhancers e promotores. A perturbação de SMARCB1 está associada à desregulação epigenética e a redes de sinalização alteradas, com forte relevância para a biologia tumoral, incluindo neoplasias deficientes em SMARCB1 e outros cânceres com disfunção do SWI/SNF. Essas características tornam SMARCB1 um alvo de alto valor para estudar transições de estado da cromatina, cooperatividade entre fatores de transcrição e regulação gênica em escala genômica.

Ini1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SMARCB1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ini1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SMARCB1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SMARCB1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ini1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SMARCB1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ini1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ini1 em células tumorais com expressão de SMARCB1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.