HYPE CRISPR Activationプラスミド (h): sc-406626-ACT

ヒトFICDはHYPEをコードしており、HYPEは小胞体（ER）に局在するFicドメイン酵素で、タンパク質基質に対する可逆的なAMPylationおよび脱AMPylationを触媒する。主要な基質としてHSPA5/BiPシャペロンが挙げられる。HYPEはBiP活性を調節することで、ERのプロテオスタシス、アンフォールドド・プロテイン・レスポンス（UPR）シグナル、ならびにタンパク質の折り畳み能と分泌に影響する適応的ストレスプログラムを形成する。この制御軸により、FICDはER恒常性、カルシウム制御、そしてプロテオトキシックストレス下での細胞生存を担う経路と結び付けられる。ERストレスとUPRシグナルの破綻は、神経変性、代謝機能障害、がん関連表現型に広く関与することが示唆されており、そのためFICD/HYPEはプロテオスタシスの機構研究に有用な結節点となる。

HYPE CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性FICDの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

HYPE CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における FICD 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はFICD転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性HYPEの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のFICD遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるHYPE依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびFICD発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるHYPE経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。