HtrA2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402576-ACT

HTRA2 codifica a serina protease mitocondrial humana HtrA2 (também conhecida como OMI), um fator de controlo de qualidade responsivo ao stress que ajuda a manter a proteostase mitocondrial. Perante disfunção mitocondrial, a HtrA2 participa na vigilância de proteínas e pode influenciar a sinalização apoptótica ao modular a atividade das caspases e ao interagir com proteínas inibidoras da apoptose, ligando a integridade mitocondrial a decisões sobre o destino celular. A atividade de HTRA2 está associada a respostas ao stress oxidativo, à dinâmica mitocondrial e a vias de stress proteotóxico que moldam a homeostase neuronal e metabólica. A desregulação de HTRA2 tem sido associada a patologia mitocondrial e tem sido investigada no contexto de neurodegeneração e de outras perturbações caracterizadas por função mitocondrial comprometida e apoptose alterada.

HtrA2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HTRA2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HtrA2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HTRA2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HTRA2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HtrA2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HTRA2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HtrA2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HtrA2 em células tumorais com expressão de HTRA2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.