HECTD3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406532-ACT

HECTD3 kodiert eine HECT-Domänen-E3-Ubiquitin-Ligase, die die Proteinstabilität und die Signalweitergabe über ubiquitinabhängige Modifikationen von Komponenten verschiedener Signalwege reguliert. Durch die Gestaltung der Ubiquitinierungsdynamik beeinflusst HECTD3 zelluläre Prozesse wie die angeborene Immun-Signalgebung, entzündliche Transkriptionsprogramme und stressresponsive Signalwege, die auf NF-κB- und interferonassoziierte Netzwerke zusammenlaufen. Eine veränderte Ubiquitin-Ligase-Aktivität und eine daraus resultierende Umprogrammierung nachgeschalteter Signalwege sind häufig an fehlregulierter Immunität und onkogenen Phänotypen beteiligt, was HECTD3 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien der Signaltransduktion und Proteostase macht. Forschende untersuchen HECTD3 häufig, um zu verstehen, wie E3-Ligasen die Stärke, Dauer und das Crosstalk von Signalwegen in humanen Zellen feinabstimmen.

HECTD3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HECTD3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HECTD3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HECTD3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HECTD3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HECTD3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HECTD3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HECTD3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HECTD3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HECTD3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.