HAI-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404011-ACT

SPINT1 codifica o inibidor‑1 do ativador do fator de crescimento de hepatócitos (HAI‑1), um inibidor de serinoproteases do tipo Kunitz associado à membrana que limita a proteólise pericelular ao inibir proteases como a HGFA e a matriptase (ST14). Ao regular a ativação do HGF e a sinalização a jusante pela via MET, o HAI‑1 influencia a homeostase epitelial, a integridade das junções célula–célula e a remodelação da matriz extracelular. Redes SPINT1–protease se cruzam com processos como diferenciação epitelial, reparo de feridas e cascatas inflamatórias de proteases. A expressão desregulada de HAI‑1 ou o desequilíbrio em relação às proteases correspondentes tem sido associado a alterações da função de barreira epitelial e a fenótipos impulsionados por proteases relatados em diversos contextos de pesquisa em câncer e doenças fibróticas.

HAI-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SPINT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HAI-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SPINT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SPINT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HAI-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SPINT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HAI-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HAI-1 em células tumorais com expressão de SPINT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.