H-Ras Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400204-ACT

HRAS codifica a H-Ras, uma pequena GTPase associada à membrana que alterna entre estados ligados a GDP e a GTP para transmitir sinais de receptores tirosina-quinase ativados para vias efetoras a jusante. H-Ras aciona a sinalização RAF–MEK–ERK e PI3K–AKT para regular proliferação, diferenciação, dinâmica do citoesqueleto e sobrevivência, com funções adicionais no tráfego vesicular e na motilidade celular. A atividade desregulada de HRAS perturba redes de sinalização mitogênica e está implicada na transformação oncogênica e em fenótipos de RASopatias do desenvolvimento. Como um nó central de sinalização, H-Ras é amplamente usado para estudar a comunicação cruzada entre vias, o controle por retroalimentação e programas transcricionais dependentes do contexto.

H-Ras O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HRAS sem alterar a sequência de ADN subjacente.

H-Ras O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HRAS em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HRAS, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de H-Ras. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HRAS nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de H-Ras no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via H-Ras em células tumorais com expressão de HRAS silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.