Plásmido CRISPR de Activación (h) G_{α t2} : sc-401528-ACT

GNAT2 codifica la subunidad alfa de la transducina de los conos, una proteína G heterotrimérica, Gαt2, un mediador clave de la fototransducción en los fotorreceptores de cono de la retina. Tras la activación de las opsinas por la luz, Gαt2 interactúa con efectores aguas abajo para regular la señalización de nucleótidos cíclicos, lo que conduce a la modulación de la actividad de los canales iónicos y a la propagación de la señal visual. Esta vía integra la señalización de receptores acoplados a proteína G (GPCR) con el metabolismo de cGMP y con mecanismos de adaptación rápida esenciales para la función de los conos. La actividad alterada de GNAT2 se asocia con fenotipos hereditarios de disfunción retiniana, por lo que es relevante para estudios de señalización específica de conos y de biología de neuronas sensoriales.

Gα t2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GNAT2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Gα t2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GNAT2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GNAT2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Gα t2 . A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GNAT2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Gα t2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Gα t2 en células tumorales con expresión de GNAT2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.