G_{α t1} Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401559-ACT

GNAT1 codifica a subunidade alfa Gαt1 da proteína G heterotrimérica (alfa da transducina), um transdutor de sinal essencial nos fotorreceptores de bastonetes que acopla a rodopsina ativada a enzimas efetoras na cascata de fototransdução. Após estimulação luminosa, a Gαt1 promove a ativação da fosfodiesterase para reduzir os níveis de cGMP, modulando a atividade dos canais regulados por nucleotídeos cíclicos e controlando a hiperpolarização da membrana. Essa via integra a sinalização por GPCR com a regulação de segundos mensageiros para sustentar a sensibilidade visual e a adaptação em condições de baixa luminosidade. A desregulação ou a expressão alterada de componentes da fototransdução, incluindo GNAT1, é relevante para estudos de disfunções retinianas hereditárias e de mecanismos que perturbam a homeostase da sinalização nos bastonetes.

Gα t1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GNAT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Gα t1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GNAT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GNAT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Gα t1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GNAT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Gα t1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Gα t1 em células tumorais com expressão de GNAT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.