G_{α s} Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400476-ACT

GNAS codifica a subunidade alfa da proteína G estimulatória, Gα s, um mediador central da sinalização por GPCR que ativa a adenilil ciclase, elevando o cAMP intracelular e acionando programas transcricionais dependentes de PKA e CREB. Por meio dessas vias, Gα s regula a responsividade hormonal, o controle metabólico e a diferenciação em diversos tecidos, integrando sinais de receptores para catecolaminas, glucagon e muitos hormônios peptídicos. O GNAS também está sujeito a um imprinting genômico complexo, que pode gerar efeitos de dosagem específicos por tecido e desequilíbrio de sinalização. A sinalização desregulada de GNAS/Gα s está associada a distúrbios endócrinos e esqueléticos e tem sido implicada na ativação oncogênica da via do cAMP em múltiplos contextos tumorais.

Gα s O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GNAS sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Gα s O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GNAS em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GNAS, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Gα s. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GNAS nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Gα s no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Gα s em células tumorais com expressão de GNAS silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.