Plasmide CRISPR d'Activation (h) G_{α o}: sc-400897-ACT

GNAO1 code la sous-unité alpha Gαo des protéines G hétérotrimériques humaines, un composant prédominant de la famille Gi/o qui couple de nombreux GPCR à la régulation d’effecteurs en aval dans des contextes neuronaux et neuroendocriniens. Après activation du récepteur, Gαo module la signalisation des seconds messagers en inhibant l’adénylate cyclase et en modulant l’activité des canaux ioniques, influençant ainsi la transmission synaptique, l’excitabilité neuronale et le trafic vésiculaire. La signalisation dépendante de GNAO1 s’interface avec les voies de l’AMPc/PKA et, plus largement, avec des réseaux régulés par les GPCR qui contrôlent la communication et la différenciation cellulaires. La dérégulation de l’expression ou de la fonction de GNAO1 est associée à des phénotypes de troubles du neurodéveloppement et du mouvement, ce qui étaye les études mécanistiques de l’équilibre de la signalisation des GPCR dans des modèles cellulaires pertinents pour la maladie.

Gα o Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GNAO1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Gα o Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GNAO1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GNAO1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Gα o. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GNAO1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Gα o au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Gα o dans les cellules tumorales présentant une expression de GNAO1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.