GRAMD1B CRISPR Activationプラスミド (h): sc-408929-ACT

ヒトのGRAMD1Bは、GRAMドメインを含む膜結合性タンパク質をコードしており、細胞内ステロール輸送および小胞体—形質膜（ER–PM）接触部位の構築に関与するとされています。GRAMドメインによる脂質センシングと特定の膜コンパートメントへのリクルートを介して、GRAMD1Bはコレステロール恒常性、膜組成、ならびに小胞輸送や細胞ストレス応答に影響する脂質依存的シグナル伝達プロセスと関連づけられています。GRAMD1Bの発現変動は、がんや免疫関連疾患を含む複数の疾患状況において、ゲノム解析およびトランスクリプトーム解析で報告されており、脂質代謝と連動した経路の機序研究における対象としての有用性が支持されています。GRAMD1Bの機能解析は、ステロール分布や膜接触ダイナミクスが細胞状態の制御およびシグナルネットワーク出力をどのように調節するかの解明に役立ちます。

GRAMD1B CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性GRAMD1Bの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

GRAMD1B CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における GRAMD1B 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はGRAMD1B転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性GRAMD1Bの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のGRAMD1B遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるGRAMD1B依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびGRAMD1B発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるGRAMD1B経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。