GPR54 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403766-ACT

KISS1R (GPR54) é um GPCR de classe A que se liga às kisspeptinas codificadas por KISS1 para regular o controle neuroendócrino do início da puberdade e a função do eixo reprodutivo. Após a ligação do ligante, o GPR54 acopla-se principalmente à Gαq/11 para estimular a sinalização da fosfolipase C, a mobilização de cálcio dependente de IP3 e as vias subsequentes de MAPK/ERK e PKC, que influenciam a expressão gênica e a excitabilidade celular. Esse nó de sinalização é central para a ativação dos neurônios hipotalâmicos de GnRH e integra sinais de desenvolvimento, metabólicos e ambientais que ajustam a liberação de gonadotrofinas. Alterações na atividade ou na expressão de KISS1R foram associadas a distúrbios do timing puberal e ao hipogonadismo hipogonadotrófico, e perturbações na via do GPR54 também são estudadas em contextos de biologia tumoral hormônio-dependente e programas de migração celular.

GPR54 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KISS1R sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GPR54 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KISS1R em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KISS1R, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GPR54. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KISS1R nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GPR54 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GPR54 em células tumorais com expressão de KISS1R silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.