Plasmide CRISPR d'Activation (h) GPR19: sc-407000-ACT

GPR19 code pour un récepteur orphelin couplé aux protéines G (GPCR), exprimé dans de nombreux tissus, et a été associé à la régulation de réseaux de signalisation cellulaires qui façonnent les programmes transcriptionnels, l’état de différenciation et la physiologie de réponse au stress. En tant que récepteur membranaire, GPR19 est bien placé pour influencer des voies couplées aux GPCR telles que la signalisation cAMP/PKA et MAPK, avec des effets en aval sur l’expression génique et l’homéostasie cellulaire. Les altérations de la signalisation des GPCR ont une large pertinence pour la régulation métabolique, la neurobiologie et la modulation immunitaire, et les changements d’expression de GPR19 ont été étudiés dans des contextes incluant l’inflammation et des phénotypes associés au cancer. La modulation des niveaux endogènes de GPR19 soutient des études mécanistiques des dynamiques de signalisation induites par le récepteur et des interactions entre voies (« cross-talk ») dans des modèles de cellules humaines.

GPR19 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GPR19 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GPR19 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GPR19 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GPR19, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GPR19. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GPR19 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GPR19 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GPR19 dans les cellules tumorales présentant une expression de GPR19 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.