GnT-I Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-409648-ACT

MGAT1 codifica a N-acetilglucosaminiltransferase I (GnT-I), uma enzima do Golgi medial que catalisa a primeira etapa comprometida na conversão de N-glicanos ricos em manose em N-glicanos complexos e híbridos. Ao iniciar a ramificação na glicosilação N-ligada, a GnT-I influencia o dobramento e a estabilidade de proteínas, o tráfego de receptores e as interações célula–célula e célula–matriz em proteínas secretadas e de membrana. A remodelação de glicanos dependente de MGAT1 integra-se às vias de processamento do Golgi e modula as saídas de sinalização de glicoproteínas envolvidas em adesão e na responsividade a fatores de crescimento. A atividade desregulada de MGAT1 e as estruturas alteradas de N-glicanos são frequentemente investigadas no contexto da biologia do câncer, da regulação imune e de distúrbios congênitos da glicosilação, como contribuintes mecanísticos para fenótipos celulares aberrantes.

GnT-I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MGAT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GnT-I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MGAT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MGAT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GnT-I. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MGAT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GnT-I no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GnT-I em células tumorais com expressão de MGAT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.