glycogen synthase 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402704-ACT

Il gene umano GYS2 codifica la glicogeno sintasi 2, l’enzima limitante la velocità, arricchito nel fegato, che catalizza l’allungamento delle catene di glicogeno a partire da UDP-glucosio, coordinando l’immagazzinamento postprandiale del glucosio e l’omeostasi glicemica sistemica. La sua attività è regolata in modo rigoroso dalla fosforilazione e dall’attivazione allosterica da parte del glucosio-6-fosfato, integrando la segnalazione insulinica con vie di nutrient-sensing che controllano il metabolismo epatico dei carboidrati. La funzione di GYS2 si interseca con il metabolismo del glicogeno, l’equilibrio della gluconeogenesi e programmi più ampi di omeostasi energetica che plasmano la fisiologia degli epatociti. Alterazioni genetiche o regolatorie di GYS2 sono state associate a una gestione anomala del glicogeno epatico e a fenotipi metabolici rilevanti per studi sulla resistenza all’insulina e su disfunzioni metaboliche correlate a livello epatico.

glycogen synthase 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GYS2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

glycogen synthase 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GYS2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GYS2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di glycogen synthase 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GYS2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da glycogen synthase 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via glycogen synthase 2 nelle cellule tumorali con espressione di GYS2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.