glycogen synthase 2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402704-ACT

O GYS2 humano codifica a glicogênio sintase 2, a enzima limitante da velocidade, enriquecida no fígado, que catalisa o alongamento das cadeias de glicogênio a partir de UDP-glicose, coordenando o armazenamento de glicose no período pós-prandial e a homeostase glicêmica sistêmica. Sua atividade é rigidamente regulada por fosforilação e por ativação alostérica por glicose-6-fosfato, integrando a sinalização de insulina com vias de detecção de nutrientes que controlam o metabolismo hepático de carboidratos. A função de GYS2 se cruza com o metabolismo do glicogênio, o equilíbrio da gliconeogênese e programas mais amplos de homeostase energética que moldam a fisiologia dos hepatócitos. Alterações genéticas ou regulatórias em GYS2 têm sido associadas a desregulação no manejo do glicogênio hepático e a fenótipos metabólicos relevantes para estudos de resistência à insulina e disfunções metabólicas relacionadas ao fígado.

glycogen synthase 2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GYS2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

glycogen synthase 2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GYS2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GYS2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de glycogen synthase 2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GYS2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de glycogen synthase 2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via glycogen synthase 2 em células tumorais com expressão de GYS2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.