GLI-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420576-ACT

O gene Gli2 de camundongo codifica a proteína GLI-2, um fator de transcrição do tipo “zinc finger” que atua como um dos principais efetores a jusante da via de sinalização Hedgehog. Após a ativação da via, a GLI-2 regula programas transcricionais que controlam o padrão embrionário, a manutenção de células-tronco/progenitoras e a especificação de linhagens, integrando sinais que impactam a proliferação e a diferenciação. A atividade desregulada de GLI-2 está associada a processos de desenvolvimento aberrantes e tem sido amplamente implicada na biologia tumoral relacionada à via Hedgehog e em contextos de remodelamento tecidual. Como regulador transcricional responsivo à via, a GLI-2 é frequentemente usada para investigar redes gênicas dirigidas por morfógenos, dependências de sinalização ciliar e o controle transcricional de decisões de destino celular em modelos murinos.

GLI-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Gli2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GLI-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Gli2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Gli2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GLI-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Gli2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GLI-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GLI-2 em células tumorais com expressão de Gli2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.