GH Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401171-ACT

Il GH2 umano codifica l’ormone della crescita (GH), un ormone peptidico di origine ipofisaria che regola la crescita somatica postnatale e l’omeostasi metabolica. La segnalazione del GH è mediata principalmente dal recettore dell’ormone della crescita e dalla successiva attività di JAK2/STAT5, con un’ulteriore modulazione delle vie MAPK e PI3K/AKT per coordinare programmi di espressione genica coinvolti nella sintesi proteica, nella lipolisi e nell’utilizzo del glucosio. Tramite l’induzione di componenti dell’asse IGF e di regolatori metabolici, l’attività di GH2 influenza la crescita dei tessuti, la ripartizione dei nutrienti e i circuiti di feedback endocrino. Una biologia del GH deregolata è rilevante nei disturbi della crescita e della composizione corporea ed è spesso oggetto di studio in modelli di ricerca endocrinologica, metabolica e dello sviluppo.

GH-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GH2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GH-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GH2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GH2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GH-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GH2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GH-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GH-2 nelle cellule tumorali con espressione di GH2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.