GCN2 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-402313-ACT

EIF2AK4 は、未荷電 tRNA の結合によってアミノ酸欠乏を感知し、栄養ストレスを翻訳制御へと結びつけるセリン／スレオニンキナーゼである GCN2 をコードします。活性化された GCN2 は eIF2α をリン酸化して統合ストレス応答（ISR）を開始し、全体的なタンパク質合成を再編する一方で、代謝ストレスや酸化ストレスへの適応を支える選択的な翻訳プログラムを促進します。このシグナルは ATF4 依存性経路を介して、オートファジー、ミトコンドリア恒常性、ならびに免疫関連の転写出力と交差します。EIF2AK4／GCN2 活性の変化は、栄養ストレスへの適応、炎症、腫瘍細胞の生存といった文脈で研究されており、ヒト細胞モデルにおけるストレスシグナル依存性を解明するうえで重要です。

GCN2 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性EIF2AK4の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

GCN2 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における EIF2AK4 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はEIF2AK4転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性GCN2の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のEIF2AK4遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるGCN2依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびEIF2AK4発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるGCN2経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。