GCKR CRISPR Activationプラスミド (h): sc-401623-ACT

ヒトのGCKRはグルコキナーゼ調節タンパク質（glucokinase regulatory protein）をコードしており、肝細胞で高発現する、グルコース利用を調節する因子です。GCKRはグルコキナーゼに結合して隔離し、栄養状態やリン酸の状態に応じて解糖系フラックスを微調整します。グルコキナーゼの利用可能性を制御することで、GCKRは肝臓におけるグルコース感知、グリコーゲン合成、ならびに解糖系とde novo脂肪新生のバランスに影響し、炭水化物代謝とトリグリセリド産生を統合します。GCKRの遺伝的多型や発現変化は、空腹時血糖、インスリン感受性、循環脂質形質の変動と関連することが報告されており、代謝疾患の病態生物学において重要な分子と考えられます。細胞モデルでは、GCKRを人為的に変化させることにより、肝臓の代謝経路ネットワークや栄養応答性の転写プログラムを解析するための扱いやすい手段が得られます。

GCKR CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性GCKRの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

GCKR CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における GCKR 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はGCKR転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性GCKRの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のGCKR遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるGCKR依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびGCKR発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるGCKR経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。