GALK1 Double Nickaseプラスミド (h): sc-405217-NIC

GALK1はガラクトキナーゼ1をコードしており、Leloir経路における最初の不可逆（コミット）段階として、ATP依存的にα-D-ガラクトースをリン酸化してガラクトース-1-リン酸へ変換する酵素です。この反応は、炭水化物フラックスをUDP-ガラクトース産生へと導き、糖鎖付加（グリコシル化）能や、より広範な細胞内のエネルギー恒常性およびヌクレオチド糖の恒常性に影響します。GALK1活性の変化はガラクトース利用と代謝産物バランスを乱し、先天性ガラクトース代謝異常の研究や、そこから派生する細胞ストレス応答への影響を検討するうえで重要です。細胞質に局在する代謝酵素として、GALK1は栄養依存的な制御や、解糖系および糖鎖生合成との経路間クロストークを解析するための、扱いやすい介入ポイントとなります。

GALK1 ダブルニカースプラスミド（h）は、human 細胞株における GALK1 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、GALK1内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、GALK1の機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、GALK1が破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。