Plásmido CRISPR de Activación (h) fumarate hydratase: sc-401660-ACT

El gen humano **FH** codifica la fumarato hidratasa (fumarasa), una enzima homotetramérica del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) que cataliza la hidratación reversible del fumarato a L-malato, vinculando el metabolismo energético mitocondrial con la anaplerosis y la homeostasis redox. Más allá del flujo central de carbono, los niveles de fumarato influyen en la señalización celular mediante la succinación de proteínas y la modulación de programas epigenéticos y asociados a la hipoxia, conectando la actividad de FH con respuestas al estrés mitocondrial y la reprogramación metabólica. La alteración de la función de FH se ha asociado con el metabolismo oncogénico y con cambios en el manejo de especies reactivas de oxígeno, lo que convierte a FH en un nodo clave para estudiar la disfunción mitocondrial, los puntos de control metabólicos y las relaciones entre genoma y metabolitos en células humanas.

fumarate hydratase El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de FH sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

fumarate hydratase El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus FH en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional FH, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de fumarate hydratase. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo FH y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de fumarate hydratase en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía fumarate hydratase en células tumorales con expresión de FH silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.