Fibromodulin Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420391-ACT

Il gene murino Fmod codifica la fibromodulina, un piccolo proteoglicano della matrice extracellulare ricco di leucine che lega i collageni e modula la fibrillogenesi, l’assemblaggio della matrice e la biomeccanica dei tessuti. La fibromodulina influenza la segnalazione cellula–matrice e la disponibilità dei fattori di crescita, incluse interazioni con TGF-β e programmi di rimodellamento correlati che modellano fibrosi, riparazione delle ferite e organizzazione dello stroma. Nei tessuti muscoloscheletrici e connettivi, un’espressione alterata di FMOD è associata a cambiamenti nell’integrità di tendini/legamenti e nell’omeostasi della cartilagine, ed è stata studiata nel contesto del rimodellamento degenerativo e del turnover della MEC guidato dall’infiammazione. Queste proprietà rendono Fmod un bersaglio utile per analizzare le vie della matrice extracellulare, gli stati di attivazione dei fibroblasti e la regolazione, dipendente dalla matrice, della migrazione e della differenziazione cellulare nei sistemi modello murini.

Fibromodulin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Fmod senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Fibromodulin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Fmod nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Fmod, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Fibromodulin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Fmod nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Fibromodulin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Fibromodulin nelle cellule tumorali con espressione di Fmod silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.