Fibrocystin CRISPR Activationプラスミド (h): sc-403635-ACT

PKHD1はフィブロシスチン／ポリダクチン（fibrocystin/polyductin）をコードしており、これは腎および胆道の上皮細胞において一次繊毛と基底小体に多く局在する、大型の膜結合性タンパク質です。そこでPKHD1産物は、繊毛形成（ciliogenesis）、機械感覚シグナル伝達、ならびに上皮の極性維持に寄与します。フィブロシスチンは、胆管およびネフロンの発生過程において、カルシウム依存性シグナル、平面内細胞極性、管腔形成（tubulogenesis）を協調させる繊毛関連経路に関与します。PKHD1の機能障害や発現異常は、常染色体劣性多発性嚢胞腎を含む肝腎線維嚢胞性表現型と強く関連しており、これは繊毛シグナル伝達および管腔形態形成の異常を反映しています。そのため、フィブロシスチン量を実験的に操作することは、腎・肝モデル系における繊毛依存的な上皮分化、ルーメン形成、ストレス応答を研究するうえで重要です。

Fibrocystin CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性PKHD1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

Fibrocystin CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における PKHD1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はPKHD1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性Fibrocystinの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のPKHD1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるFibrocystin依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびPKHD1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるFibrocystin経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。