FAK Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420280-ACT

A proteína tirosina quinase 2 (Ptk2) codifica a quinase de adesão focal (FAK), uma tirosina quinase não receptora que integra sinais de integrinas e de receptores de fatores de crescimento para coordenar a renovação das adesões focais e a remodelação do citoesqueleto de actina. Em células de camundongo, a FAK regula a adesão, migração, polaridade e sobrevivência celular por meio de vias que incluem PI3K–AKT, MAPK/ERK, sinalização por GTPases da família Rho e cascatas de fosforilação dependentes de SRC. A FAK também se conecta a programas de mecanotransdução que acoplam a rigidez da matriz extracelular a respostas transcricionais e à contratilidade celular. A desregulação da sinalização de FAK está associada a alterações na remodelação tecidual, microambientes inflamatórios e fenótipos invasivos, tornando o Ptk2 um alvo amplamente estudado em modelos de progressão tumoral, fibrose e biologia vascular.

FAK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ptk2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FAK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ptk2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ptk2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FAK. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ptk2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FAK no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FAK em células tumorais com expressão de Ptk2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.