Plásmido CRISPR de Activación (h) Exo1: sc-402356-ACT

El EXO1 humano codifica Exo1, una exonucleasa 5′→3′ que funciona en la resección de extremos de ADN y en el procesamiento de intermediarios de recombinación durante la recombinación homóloga y la reparación de roturas de doble cadena del ADN. Exo1 también participa en la reparación de errores de apareamiento del ADN al colaborar con los complejos MutS/MutL para escindir nucleótidos mal apareados, ayudando a preservar la integridad del genoma durante la replicación. A través de sus funciones en el mantenimiento de la horquilla de replicación, la señalización de puntos de control y la elección de la vía de reparación, EXO1 influye en las respuestas celulares al estrés genotóxico y en la estabilidad cromosómica. La desregulación de la expresión o la actividad de EXO1 se ha relacionado con una mayor carga mutacional y con fenotipos de inestabilidad genómica que se estudian con frecuencia en biología del cáncer y en contextos hereditarios de deficiencia en la reparación del ADN.

Exo1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de EXO1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Exo1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus EXO1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional EXO1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Exo1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo EXO1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Exo1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Exo1 en células tumorales con expresión de EXO1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.