ERGIC-53 Plasmide Double Nickase (h): sc-401602-NIC

LMAN1 codifica ERGIC-53, una lectina specifica per il mannosio che cicla tra il reticolo endoplasmatico (ER), il compartimento intermedio ER–Golgi (ERGIC) e il cis-Golgi per promuovere il traffico di specifici carichi glicoproteici. Nell’ambito della via secretoria precoce, ERGIC-53 coopera con il cofattore MCFD2 per supportare l’uscita dall’ER e il controllo qualità delle proteine correttamente ripiegate, collegando la cattura del carico mediata da lectine al trasporto dipendente da COPII. L’alterazione dello smistamento dipendente da LMAN1 può perturbare la secrezione proteica e l’omeostasi dell’ER, rendendolo rilevante per studi su proteostasi, traffico dipendente dalla glicosilazione e risposte allo stress della via secretoria. Varianti umane di LMAN1 con perdita di funzione sono associate alla carenza combinata dei fattori della coagulazione V e VIII, fornendo un quadro genetico per indagare meccanismi di secrezione specifici per il carico senza implicare un uso clinico.

ERGIC-53 Il plasmide Double Nickase (h) consiste in una coppia di plasmidi ingegnerizzati per l'editing ad alta specificità del locus LMAN1 nelle linee cellulari human. Ciascun plasmide esprime una nickasi Cas9 D10A e un sgRNA distinto che prende di mira filamenti di DNA opposti all'interno di LMAN1. Quando indirizzate verso siti adiacenti su filamenti di DNA opposti, le due nickasi generano tagli a filamento singolo sfalsati che insieme producono una rottura a doppio filamento sfalsata, richiedendo un'attività coordinata sul bersaglio da entrambe le guide. La rottura del DNA risultante viene risolta da vie di riparazione cellulare endogene, più comunemente attraverso la giunzione non omologa delle estremità (NHEJ), portando a inserzioni o delezioni che interrompono la funzione di LMAN1. Richiedendo il coinvolgimento di due sgRNA nel locus bersaglio, l'approccio a doppia nickasi migliora la specificità dell'editing e fornisce una strategia CRISPR complementare per applicazioni in cui è desiderato un controllo aggiuntivo sulla precisione del targeting.

Per supportare l'identificazione efficiente delle cellule modificate, un plasmide codifica la GFP per la visualizzazione fluorescente delle popolazioni trasfettate, mentre il plasmide di accompagnamento porta un gene di resistenza alla puromicina per la selezione antibiotica. Insieme, queste caratteristiche supportano l'arricchimento efficiente delle popolazioni co-trasfettate e semplificano la convalida dei cloni con LMAN1 interrotto.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.