epiplakin 1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404271-ACT

EPPK1 codifica a epiplakina 1, uma grande proteína citoligadora da família plakin que se associa aos filamentos intermediários de queratina e contribui para a organização do citoesqueleto e para a estabilidade mecânica do epitélio. Ao atuar como suporte (scaffold) para redes de filamentos, a epiplakina influencia processos como adesão celular, migração e respostas ao estresse, que são essenciais para a homeostase epitelial e a integridade da barreira. Alterações no acoplamento do citoesqueleto e na arquitetura epitelial são frequentemente implicadas em lesão e remodelamento tecidual, tornando o EPPK1 um marcador relevante para estudar estados de diferenciação epitelial e reorganização induzida por estresse. Assim, sua expressão e suas funções associadas a filamentos são de interesse em áreas de pesquisa que abrangem biologia epitelial, dano tecidual associado à inflamação e plasticidade de células tumorais.

epiplakin 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EPPK1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

epiplakin 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EPPK1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EPPK1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de epiplakin 1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EPPK1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de epiplakin 1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via epiplakin 1 em células tumorais com expressão de EPPK1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.