ENT2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401952-ACT

O SLC29A2 humano codifica o transportador equilibrativo de nucleosídeos 2 (ENT2), um transportador bidirecional da membrana plasmática que facilita o fluxo independente de Na+ de nucleosídeos de purinas e pirimidinas através das membranas celulares. O ENT2 ajuda a regular a via de salvamento de nucleosídeos, os pools intracelulares de nucleotídeos e o manejo da adenosina extracelular, conectando o transporte de membrana à síntese de DNA/RNA, ao metabolismo energético e à sinalização purinérgica. Ao influenciar a disponibilidade de substratos para a biossíntese de nucleotídeos e a captação/efluxo de fármacos, o ENT2 é relevante para estudos de controle proliferativo, respostas ao estresse metabólico e sensibilidade a análogos de nucleosídeos em sistemas modelo. Alterações no transporte de nucleosídeos e na homeostase de purinas têm sido implicadas em contextos fisiopatológicos, incluindo inflamação, sinalização relacionada à isquemia e biologia tumoral, sustentando o uso de ferramentas focadas em ENT2 para investigar fenótipos impulsionados pelo transporte.

ENT2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC29A2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ENT2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC29A2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC29A2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ENT2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC29A2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ENT2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ENT2 em células tumorais com expressão de SLC29A2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.