Eme1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403404-ACT

O EME1 humano codifica a Eme1, uma endonuclease específica de estrutura que forma o complexo MUS81–EME1 para resolver junções de Holliday e outros intermediários de DNA ramificado gerados durante a replicação do DNA e a recombinação homóloga. Essa atividade nucleásica favorece o reinício da forquilha de replicação, o processamento de forquilhas estagnadas ou colapsadas e a manutenção da estabilidade do genoma, conectando o EME1 à coordenação do checkpoint da fase S e às vias de resposta a danos no DNA. A desregulação do reparo de DNA dependente de MUS81–EME1 pode aumentar a instabilidade cromossômica, uma marca registrada de muitos cânceres, e é relevante para o estudo de mecanismos que determinam a sensibilidade ao estresse replicativo e a agressões genotóxicas.

Eme1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EME1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Eme1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EME1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EME1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Eme1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EME1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Eme1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Eme1 em células tumorais com expressão de EME1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.