EAAT3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401539-ACT

SLC1A1 codifica o transportador de aminoácidos excitatórios 3 (EAAT3), um transportador de glutamato e aspartato de alta afinidade dependente de sódio, que ajuda a regular os níveis extracelulares de aminoácidos excitatórios e a garantir a disponibilidade intracelular de glutamato para o metabolismo e o equilíbrio redox. A atividade do EAAT3 contribui para a depuração de neurotransmissores, a homeostase da sinalização sináptica e a vulnerabilidade neuronal ao estresse oxidativo, por meio de vias dependentes de glutamato que se interligam com a captação de cisteína e a síntese de glutationa. Em tecidos humanos, o SLC1A1 está associado a processos de transporte neuronal e epitelial e tem sido estudado no contexto de alterações na neurotransmissão excitatória e nas respostas ao estresse celular. Mudanças genéticas e de expressão em SLC1A1 têm sido associadas a fenótipos neuropsiquiátricos e do neurodesenvolvimento, o que tem motivado estudos mecanísticos sobre a regulação do transportador e a sinalização a jusante.

EAAT3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC1A1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EAAT3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC1A1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC1A1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EAAT3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC1A1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EAAT3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EAAT3 em células tumorais com expressão de SLC1A1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.