E2F-6 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403615-ACT

E2F6 codifica a E2F-6, um regulador transcricional atípico da família E2F que atua predominantemente como repressor transcricional, independentemente da ligação à RB. Contribui para o controlo do ciclo celular e para a diferenciação ao silenciar genes responsivos a E2F envolvidos na replicação do DNA e na entrada em fase S, e participa na repressão associada à cromatina através do recrutamento de complexos do grupo Polycomb. Por estes mecanismos, o E2F-6 ajuda a manter programas transcricionais adequados durante o desenvolvimento e em transições de estado celular. A atividade desregulada de E2F6 tem sido associada a alterações da proliferação e do controlo epigenético na biologia do cancro, tornando-o relevante para estudos de redes transcricionais oncogénicas e de plasticidade de linhagem.

E2F-6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de E2F6 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

E2F-6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus E2F6 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição E2F6, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de E2F-6. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus E2F6 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de E2F-6 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via E2F-6 em células tumorais com expressão de E2F6 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.