DNA pol θ Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407414-ACT

POLQ codifica a DNA polimerase teta (DNA pol θ), uma polimerase da família A propensa a erros, com atividade semelhante à de helicase, que é central na junção de extremidades mediada por micro-homologia (MMEJ), também denominada junção de extremidades mediada pela polimerase teta (TMEJ). A DNA pol θ auxilia no reparo de quebras de dupla fita e contribui para a tolerância ao estresse replicativo, influenciando a estabilidade do genoma por meio de vias alternativas de junção de extremidades do DNA que atuam quando a NHEJ clássica ou a recombinação homóloga estão comprometidas. A atividade de POLQ tem sido associada a assinaturas mutacionais e a rearranjos cromossômicos relacionados às respostas a danos no DNA, tornando-a relevante para estudos de instabilidade genômica, lesões associadas à replicação e escolha de vias no reparo de quebras de dupla fita. Como resultado, POLQ é amplamente investigado em mecanismos de reparo do DNA, interações de letalidade sintética e modelos de fenótipos de dano ao DNA associados a doenças.

DNA pol θ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de POLQ sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DNA pol θ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus POLQ em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição POLQ, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DNA pol θ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus POLQ nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DNA pol θ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DNA pol θ em células tumorais com expressão de POLQ silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.