Plasmide CRISPR d'Activation (h2) DNA pol δ 3: sc-411506-ACT-2

Le gène humain POLD3 code la sous-unité 3 de l’ADN polymérase delta (ADN pol δ 3), un composant accessoire de l’holoenzyme polymérase δ qui accroît la processivité de la synthèse d’ADN et soutient la réplication du brin retardé dépendante de PCNA. POLD3 contribue au maintien du génome grâce à des rôles dans la réparation de l’ADN et la tolérance aux dommages, notamment lors de la resynthèse d’ADN pendant la recombinaison homologue et d’autres processus de réparation associés à la réplication qui stabilisent les fourches de réplication bloquées. La perturbation de la fonction de POLD3 a été associée à un stress réplicatif, à une augmentation de la charge mutationnelle et à une instabilité génomique observée dans de multiples contextes de cancer, ce qui en fait un élément pertinent pour l’étude de l’évolution tumorale et des dépendances en matière de réparation de l’ADN. Des outils d’édition génétique ciblant POLD3 sont utiles pour disséquer les voies de réparation couplées à la réplication, cartographier des interactions de létalité synthétique au sein du réseau de réponse aux dommages de l’ADN et évaluer les effets sur la progression du cycle cellulaire et l’intégrité du génome dans des modèles cellulaires humains.

DNA pol δ 3 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de POLD3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DNA pol δ 3 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus POLD3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription POLD3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DNA pol δ 3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus POLD3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DNA pol δ 3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DNA pol δ 3 dans les cellules tumorales présentant une expression de POLD3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.