Delta-3 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420011-ACT

Mouse Dll3 kodiert Delta-3, einen atypischen Liganden der Notch-Familie, der vor allem während der Embryonalentwicklung und Gewebemusterbildung die Signalübertragung über Notch-Rezeptoren moduliert. Delta-3 ist im präsomitischen Mesoderm angereichert, wo es über die Regulation der Dynamik des Notch-Signalwegs und laterale Inhibition zur Segmentierungsuhr und zur Ausbildung der Somiten-Grenzen beiträgt. Indem Dll3 Zellschicksalsentscheidungen und Differenzierungsprogramme mitprägt, beeinflusst es neurogene und myogene Linien sowie übergeordnete morphogenetische Prozesse. Eine fehlregulierte, DLL3-assoziierte Notch-Signalgebung wurde mit Entwicklungsanomalien in Verbindung gebracht und wird in der Forschung zur Neuroendokrinen Tumorbiologie häufig als Marker genutzt, was mechanistische Studien zur Kontrolle des Signalwegs unterstützt.

Delta-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Dll3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Delta-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Dll3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Dll3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Delta-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Dll3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Delta-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Delta-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Dll3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.