Delta-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402857-ACT

Das humane DLL3 kodiert Delta-3, einen atypischen Delta-ähnlichen Liganden, der das Notch-Signal während der embryonalen Entwicklung moduliert, insbesondere bei der Somitogenese und der Spezifikation neuroendokriner Zelllinien. Im Gegensatz zu kanonischen Notch-Liganden ist DLL3 überwiegend in intrazellulären Kompartimenten lokalisiert, wo es den Rezeptor‑Ligand‑Transport beeinflussen und die Signalstärke des Notch‑Signalwegs feinabstimmen kann, was Zellschicksalsentscheidungen und Differenzierungsprogramme mitprägt. Eine fehlregulierte DLL3-Expression ist eng mit der Biologie neuroendokriner Tumoren und veränderten, Notch-abhängigen transkriptionellen Netzwerken assoziiert, was DLL3 zu einem nützlichen Marker und einem mechanistischen Knotenpunkt für die Untersuchung von Linienplastizität macht. DLL3-getriebene Störungen des Signalwegs sind zudem relevant für Modelle der Entwicklungsmusterbildung und der transkriptionellen Kontrolle von Vorläuferzuständen.

Delta-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DLL3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Delta-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DLL3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DLL3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Delta-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DLL3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Delta-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Delta-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DLL3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.