Plasmide CRISPR d'Activation (h) DDIT3/CHOP/GADD153: sc-400051-ACT

DDIT3, également connu sous le nom de CHOP/GADD153, code un facteur de transcription bZIP induit par le stress, qui intègre les signaux issus de la réponse aux protéines mal repliées (UPR) et de la réponse intégrée au stress (ISR). Il est fortement induit en aval de la voie PERK–eIF2α–ATF4 lors du stress du réticulum endoplasmique et module des programmes transcriptionnels contrôlant l’apoptose, l’autophagie, l’équilibre redox et la régulation du cycle cellulaire. DDIT3 influe sur l’issue adaptative versus terminale du stress en modifiant l’expression de gènes impliqués dans le repliement des protéines, le métabolisme des acides aminés et la fonction mitochondriale. Une dérégulation de la signalisation de DDIT3 a été associée à la survie des cellules cancéreuses sous stress protéotoxique, à des phénotypes de stress métabolique et neurodégénératif, ainsi qu’à des événements de fusion oncogénique tels que FUS–DDIT3 dans le liposarcome myxoïde.

DDIT3/CHOP/GADD153 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DDIT3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DDIT3/CHOP/GADD153 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DDIT3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DDIT3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DDIT3/CHOP/GADD153. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DDIT3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DDIT3/CHOP/GADD153 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DDIT3/CHOP/GADD153 dans les cellules tumorales présentant une expression de DDIT3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.