CrkRS Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402238-ACT

O CDK12 humano codifica uma quinase dependente de ciclina que se associa à Ciclina K para fosforilar o CTD da RNA polimerase II, coordenando o alongamento da transcrição com o processamento de RNA co-transcricional. O CDK12 é particularmente importante para manter a expressão de genes longos e complexos envolvidos na resposta a danos no DNA, na tolerância ao stress de replicação e na manutenção da estabilidade do genoma, ligando-o às redes de recombinação homóloga e de sinalização de checkpoints. A perturbação da função do CDK12 altera programas transcricionais que regulam a progressão do ciclo celular e a escolha de vias de reparação, com efeitos a jusante sobre a integridade cromossómica e a aptidão celular. Na investigação biomédica, o CDK12 é frequentemente estudado no contexto do acoplamento desregulado entre transcrição e reparação e da sua associação a fenótipos de instabilidade genómica observados em múltiplos modelos de doença.

CrkRS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CDK12 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CrkRS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CDK12 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CDK12, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CrkRS. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CDK12 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CrkRS no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CrkRS em células tumorais com expressão de CDK12 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.