CRF-RI Double Nickaseプラスミド (h): sc-400730-NIC

ヒトCRHR1は、コルチコトロピン放出ホルモン受容体1（CRF-R1）をコードしており、CRHペプチドに結合してストレス応答性シグナル伝達を開始するクラスBのGPCRである。リガンド結合により主としてGs／アデニリルシクラーゼ–cAMP–PKAカスケードが活性化され、さらにMAPK/ERKなどの追加経路にも共役しうることで、内分泌出力、神経の興奮性、免疫調節を制御する転写プログラムが形成される。CRF-R1シグナルは視床下部—下垂体—副腎（HPA）軸およびより広範な神経内分泌ホメオスタシスと連関しており、受容体活性をストレス下での細胞適応と結び付ける。CRHR1の発現やシグナル伝達の異常は、ストレス反応性の変化や神経精神疾患様の表現型と関連づけられており、関連する神経細胞および末梢細胞モデルにおける機構研究を支持する知見となっている。

CRF-RI ダブルニカースプラスミド（h）は、human 細胞株における CRHR1 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、CRHR1内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、CRHR1の機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、CRHR1が破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。