CRB3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403145-ACT

CRB3 (crumbs homolog 3) codifica uma proteína de polaridade apical que se localiza em complexos associados às junções oclusivas (tight junctions) e ajuda a organizar a arquitetura das células epiteliais. Ao sustentar a polaridade ápico-basal, a integridade das junções e o tráfego vesicular, a CRB3 contribui para processos como a formação de lúmen, a ciliogênese e a proliferação regulada por meio de redes de sinalização associadas à polaridade. Alterações na expressão ou na localização de CRB3 têm sido associadas à perda da organização epitelial e à desregulação da homeostase tecidual, características frequentemente investigadas em estudos de progressão tumoral e metástase. Como determinante de polaridade conservado, CRB3 é amplamente utilizada como um marcador molecular para investigar a diferenciação epitelial e a função de barreira em modelos de células humanas.

CRB3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CRB3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CRB3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CRB3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CRB3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CRB3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CRB3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CRB3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CRB3 em células tumorais com expressão de CRB3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.