Plasmide CRISPR d'Activation (h) COL1A1: sc-400064-ACT

COL1A1 code la chaîne pro-α1 du collagène de type I, un composant fibrillaire majeur de la matrice extracellulaire (MEC) qui s’assemble en hétérotrimères et confère une résistance à la traction aux tissus conjonctifs. Sa biosynthèse implique un traitement dans le réticulum endoplasmique (RE), l’hydroxylation de la proline et de la lysine, la formation de la triple hélice, la sécrétion et la réticulation extracellulaire, en s’intégrant à l’organisation de la MEC, à la signalisation des adhérences focales et aux programmes fibrogéniques induits par le TGF-β. L’expression de COL1A1 est étroitement régulée lors de la réparation des plaies et du remodelage stromal, et est fréquemment utilisée comme indicateur de l’activation des fibroblastes et du dépôt de matrice. Une dérégulation de COL1A1 contribue à la fibrose pathologique et à la desmoplasie associée aux tumeurs, et des anomalies germinales du collagène de type I sont liées à des maladies héréditaires du tissu conjonctif.

COL1A1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de COL1A1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

COL1A1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus COL1A1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription COL1A1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de COL1A1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus COL1A1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de COL1A1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie COL1A1 dans les cellules tumorales présentant une expression de COL1A1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.