Cochlin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405944-ACT

COCH codifica a cochlin, uma glicoproteína secretada da matriz extracelular, enriquecida em tecidos do ouvido interno, onde contribui para a organização da matriz, a adesão célula–matriz e a homeostase mecanossensorial. A cochlin contém domínios LCCL e semelhantes ao fator A de von Willebrand, que sustentam interações proteína–proteína e podem influenciar a proteólise extracelular e a sinalização inflamatória em microambientes locais. Alterações na expressão de COCH ou variantes estão associadas a disfunção auditiva e vestibular hereditária, ligando a biologia da cochlin a vias que governam a remodelação da matriz extracelular e as respostas ao stress. Essas características tornam COCH um modelo útil para estudar como componentes secretados da matriz regulam a integridade tecidual e a fisiologia de órgãos sensoriais.

Cochlin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de COCH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cochlin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus COCH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição COCH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cochlin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus COCH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cochlin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cochlin em células tumorais com expressão de COCH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.