CIS Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402619-ACT

O CISH humano codifica a proteína contendo SH2 induzível por citocinas (CIS), um adaptador da família SOCS que atenua a sinalização de receptores de citocinas ao se ligar a alvos fosforilados e promover sua degradação mediada por ubiquitina. A CIS atua como um regulador de retroalimentação negativa das vias JAK/STAT a jusante de receptores de citocinas da família da IL-2 e de sinais imunomodulatórios relacionados, moldando a ativação, a proliferação e a diferenciação de linfócitos. Por meio de seu domínio SH2 e da SOCS box, a CIS influencia a amplitude e a duração do sinal, que se cruzam com programas mais amplos de inflamação e regulação do crescimento. A desregulação da expressão de CISH ou da atividade da CIS tem sido associada a alterações na responsividade imune e na biologia de doenças inflamatórias, tornando-a um nó útil para estudos mecanísticos de redes de sinalização por citocinas.

CIS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CISH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CIS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CISH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CISH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CIS. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CISH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CIS no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CIS em células tumorais com expressão de CISH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.