CIN85 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402573-ACT

SH3KBP1 codifica a CIN85, uma proteína adaptadora multidomínio que coordena interações proteína–proteína por meio de domínios SH3 para regular o tráfego e a endocitose de receptores tirosina-quinase. A CIN85 participa da atenuação da sinalização de EGFR e c-Met, da internalização mediada por clatrina e da montagem de complexos de triagem dependentes de ubiquitina por meio de interações com CBL e com a maquinaria endocítica. Por essas vias, influencia a remodelação do citoesqueleto, a migração celular e a duração do sinal em redes ligadas a MAPK e PI3K. A desregulação do tráfego associado à CIN85 e da dinâmica de sinalização tem sido implicada em contextos de proliferação e invasão aberrantes e de sinalização alterada de células imunes na biologia de doenças humanas.

CIN85 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SH3KBP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CIN85 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SH3KBP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SH3KBP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CIN85. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SH3KBP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CIN85 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CIN85 em células tumorais com expressão de SH3KBP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.