Chr-B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401478-ACT

CHGB codifica a cromogranina B (Chr-B), uma proteína ácida dos grânulos secretores, enriquecida em células neuroendócrinas e neuronais, que sustenta a secreção regulada e a biogénese de vesículas de núcleo denso. A Chr-B participa na triagem e maturação da carga dos grânulos, contribuindo para a eficiência da exocitose acoplada a estímulos e para a libertação de hormonas peptídicas/neuropeptídeos. Pelas suas funções na homeostase da via secretora, o CHGB é frequentemente estudado em contextos que envolvem diferenciação neuroendócrina, função de vesículas do tipo sináptico e sinalização dependente de cálcio ligada ao tráfego vesicular. Alterações na expressão ou no processamento de CHGB têm sido investigadas em perturbações caracterizadas por disfunção secretora e desequilíbrio neuroendócrino, oferecendo um ponto de entrada molecular para estudos mecanísticos em modelos celulares relevantes para a doença.

Chr-B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CHGB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Chr-B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CHGB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CHGB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Chr-B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CHGB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Chr-B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Chr-B em células tumorais com expressão de CHGB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.