cGKII Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404138-ACT

PRKG2 codifica a proteína quinase II dependente de cGMP (cGKII), uma quinase de serina/treonina associada à membrana que converte sinais de óxido nítrico–cGMP em programas de fosforilação que controlam o transporte de íons, a secreção e a fisiologia da barreira epitelial. A cGKII modula o CFTR e outros canais/transportadores e se integra à sinalização cGMP/PKG para influenciar a homeostase celular em tecidos como intestino, rim e osso. Na placa de crescimento, a atividade de PRKG2 limita a diferenciação hipertrófica dos condrócitos e sustenta a ossificação endocondral, relacionando essa via à regulação do crescimento esquelético. A desregulação da sinalização de PRKG2 tem sido associada a fenótipos ósseos do desenvolvimento e a alterações mais amplas da via do cGMP relevantes para estudos de função epitelial e de sinalização celular.

cGKII O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PRKG2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

cGKII O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PRKG2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PRKG2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de cGKII. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PRKG2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de cGKII no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via cGKII em células tumorais com expressão de PRKG2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.