CatSper Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403796-ACT

CATSPER1 codifica a CatSper, uma subunidade de um canal de cálcio específico de espermatozoides, ativado por pH e por voltagem, que integra o complexo CatSper na membrana do flagelo. O influxo de Ca2+ mediado pela CatSper é um regulador central da motilidade hiperativada dos espermatozoides e da sinalização associada à capacitação, integrando a homeostase iônica a alterações a jusante no batimento flagelar e no uso de energia. A disfunção de CATSPER1 perturba programas de motilidade dependentes de cálcio e está associada a fenótipos de fertilidade masculina comprometida, tornando-o um alvo-chave para estudos mecanísticos da fisiologia espermática. Em pesquisas de biologia reprodutiva humana, CATSPER1 também é usado para investigar como a regulação de canais iônicos se articula com vias de segundos mensageiros e com a função espermática em condições fisiológicas e de estresse.

CatSper O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CATSPER1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CatSper O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CATSPER1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CATSPER1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CatSper. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CATSPER1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CatSper no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CatSper em células tumorais com expressão de CATSPER1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.